安捷伦安理荟知识小课堂—免疫组化分析前注意事项之冷缺血时间、登记和肉眼检查

文章转载自“安捷伦诊断与基因组学”公众号

组织学处理从组织样本获得开始，一直到 IHC 结果的分析，大致分为三个主要阶段：分析前、分析中和分析后。分析前因素会对靶标的准确检测产生明显甚至不良的影响。本次会讨论 IHC 和/或 ISH 制备切片时应考虑的一些分析前问题，例如冷缺血时间、登记和文件记录及肉眼检查。

图 1 分析前阶段的处理步骤概览。

分析前阶段是组织从其营养来源（血液供应）中取出开始，其中组织的固定时间很关键 (1)。蛋白降解主要是由自溶引起的。自溶是细胞内所含酶进行自我消化的过程， 通常自溶会立即开始作用。这个过程会随温度升高而加速。固定用来停止降解，同时尽可能保留组织成分的结构和完整性。然而，固定本身会引起假象。理想的固定也应同时保持组织中所有表位的结构，但这是无法实现的，因为固定引起的化学结构改变必然会改变至少一部分的表位。接下来，我们看冷缺血时间，登记和记录及肉眼检查需要的注意事项。

冷缺血时间

最近，“冷缺血时间”以及其可能对 IHC 结果产生的影响受到更多的关注。冷缺血的时间是从组织从身体中取出到组织开始。此时间应尽可能短，在已发布的指南中为 1 小时或以下 (2, 3)。图 2.2 和图 2.3 说明了延迟固定的有害影响，可能包括免疫反应性增强、减低或移位。需要注意的是，由于缺血导致的表位降解无法通过抗原修复技术来恢复。

关于特定抗原或 I 类分子靶标的缺血效应的研究相对较少。 尽管如此，图 2 显示了三个 I 类靶标中染色模式的变化。如果将缺血时间记录作为所有标本要求文件的一部分后，可能更易于广泛了解缺血时间与不同靶标之间的相互关系。

图 2.2 冷缺血改变了 MDA-MB-453 细胞（2+ 细胞系）中 HER2 的染色强度。立即（0 小时）固定在 10% NBF 中的细胞团中可观察到大约一半细胞为弱至中度的膜染色。仅 1 小时的冷缺血（细胞团在盐水浸湿的纱布下保持湿润）形 态已经正在退变，并且膜染色的细胞数量似乎有所增加。两个小时后，染色强度增加。4 小时冷缺血时间后，大部分膜染色缺失，细胞保存较差。这说明需 要及时固定，不同的冷缺血时间会导致细胞膜过染色或染色不足。使用 IHC 和 HER2 抗体（A0485）和 Autostainer Link 48 平台进行细胞染色。

图 2.3 MDA-MB-453 (Ki-67 & Cyclin D1) 和 MDA-MB-231 (p53) 细胞团立即（0 小时）在 10% NBF 中固定或在放入 NBF 前保持 1 小时、2 小时或 4 小时（固定前将细胞团在盐水浸湿的纱布下保持湿润）。对于 Ki-67 和 p53，随着 冷缺血时间的增加，由于抗原从细胞核中移位，逐渐观察到更多的“结缔组 织”染色。对于 Cyclin D1，观察到染色逐渐丢失，并出现一些移位。切片使用 Autostainer Link 48 平台进行染色，采用 FLEX 检测和以下的 FLEX RTU 一 抗：MIB-1 (Ki-67)、DO-7 (p53) 和 EP12 (Cyclin D1)。

登记和文件记录

实验室接收标本后，会对其进行“登记”并分配唯一的可追溯编号。每个手术标本随附的文件（申请）应包括：患者和医生信息、采集日期、临床信息、标本部位和类型、采集时间、冷缺血时间、固定剂类型和固定时间(3)。如果需要对标本进行脱钙，还必须记录以下信息：脱钙前固定的时间、使用的脱钙类型、脱钙时间和任何脱钙后处理 (4)。登记期间的标本验证过 程中应确认申请中的信息是否与标本容器上的信息匹配。标本容器应至少有两个标识信息，例如患者姓名和出生日期。

有充分研究表明，在 10% 中性缓冲福尔马林溶液中的时间长度对 IHC 结果有不同的影响。然而，获取所有标本所需的信息可能存在挑战。例如，2010 年进行的一项调查旨在确定 757 家实验室是否符合美国临床肿瘤学会/美国病 理学家协会 (ASCO/CAP) HER2 检测指南要求，其结果显示大约 28% 的受访机构在病例报告中没有包含固定处理信息 (5)。报告固定时间对于判定和排除异常或预期外结果很有价值。还可能影响方案选择，例如所需抗原修复或酶消化的类 型或时间以及对照材料的选择 (6)。采集团队（通常是临床或外科团队）应负责提供标本信息，包括冷缺血时长和将标本置于固定液中的时间。病理学团队有责任制定指南，其中应明确概述确定标本是否可用于 IHC 染色的标准。

肉眼检查

标本认定为合格后，即可对其进行大体检查。此过程称为肉眼检查，是一种关键的分析前步骤，并需要适当培训。较大的样品应进行“面包样”切片成大约 5 mm 的厚度并放置在 10% NBF 中。可以在薄片之间放置纱布或纸巾以便于暴露固定剂。必须注意以标准化方式处理每种类型的组织，避免对组织造成物理损伤。通常，需要从较大的标本中选择关注的区域。这些组织片或块应修剪为长度和宽度不超过 20 mm，或厚度不超过 4 - 5 mm 的尺寸。然后将修剪过的组织放入包埋盒中，并立即浸入所需的固定剂（通常为 10%NBF）中。固定液的体积应约为标本体积的 10 - 20 倍(3, 7)。福尔马林溶液会相对较快地进入组织，但实际固定组织的化学过程耗时更长，至少需要 24 小时(8)。在计算固定的总时间时，必须包括标本在肉眼检查区域和自动组织脱水机上置于 10%NBF 中的时间。

 以上内容仅限研究使用。不可用于诊断目的。